NOVA PECTINASE FÚNGICA DE Cunninghamella echinulata PA3S12MM: AVALIAÇÃO DO EFEITO DA TEMPERATURA E DO pH SOBRE A ATIVIDADE CATALÍTICA
1VITORIA MACIEL DELAI, 2JOSÉ LUIS DA CONCEIÇÃO SILVA, 3RITA DE CÁSSIA GARCIA SIMÃO, 4MARINA KIMIKO KADOWAKI, 5ALEXANDRE MALLER
1Discente, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel – Bolsa Fundação Araucária 2Docente, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus Cascavel 3Docente, Programa de Pós-Graduação em Biociências e Saúde, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus Cascavel 4Docente, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus Cascavel 5Docente, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus Cascavel
Introdução: As enzimas são catalisadores biológicos fundamentais ao metabolismo de todos os seres vivos e têm se destacado por suas aplicações industriais, em razão da alta eficiência em promover reações químicas, compatibilidade ambiental e viabilidade econômica. Entre as hidrolases, as pectinases estão entre as mais produzidas comercialmente, apresentando crescimento médio anual de 2,86 % e ampla aplicação nos setores alimentício, têxtil, de papel e farmacêutico (JOHN et al., 2020). Trata-se de um grupo de enzimas hidrolíticas responsáveis pela degradação de substâncias pécticas, atuando sinergicamente na lamela média e na parede celular primária das plantas (LASWAI et al., 2024). Essas enzimas podem ser produzidas por plantas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias. Destacam-se, ainda, por seu papel na clarificação de sucos e vinhos, na fermentação de café e chá, além de contribuírem para a extração de óleos vegetais (SINGH et al., 2024). Objetivo: O objetivo do presente estudo foi caracterizar bioquimicamente a pectinase de C. echinulata PA3S12MM, segundo os parâmetros de temperatura e pH, visando sua aplicação biotecnológica. Material e métodos: A atividade enzimática foi quantificada segundo Miller (1959), utilizando pectina cítrica 1 % em tampão acetato de sódio 100 mM pH 5,0 como substrato. Uma unidade enzimática foi a quantidade de enzima que liberou 1 µmol de ácido galacturônico por minuto nas condições do ensaio. A determinação da temperatura ótima de atividade da pectinase foi conduzida através da dosagem de açúcar redutor pelo método descrito por Miller (1959) em diferentes temperaturas, de 30 a 80 ºC. A fim de determinar a estabilidade térmica, a enzima foi incubada na ausência do substrato em diferentes temperaturas: 50, 60, 70 °C. Alíquotas foram coletadas em determinados tempos: 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 e 120 minutos para avaliação da atividade enzimática. A influência do pH na atividade enzimática foi verificada, solubilizando o substrato da reação (pectina cítrica), em tampão citrato-fosfato 50 mM (tampão McIlvaine), variando o pH entre 3,0 e 9,0. Em seguida foi avaliada a atividade. A estabilidade ao pH foi investigada mediante incubação da enzima na ausência de substrato em três diferentes tampões à 4 °C por 24 horas, seguindo pela dosagem de açúcares redutores no pH ótimo e temperatura ótima de reação. Os tampões utilizados foram: citrato-fosfato 0,1 mol L-1 (pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 e 8,0), e glicina 0,2 mol L-1 (9,0 e 10). Resultados: Os resultados indicam que a pectinase apresentou máxima atividade enzimática a 50 °C, com redução gradual em temperaturas inferiores ou superiores a esse valor. Nos ensaios de estabilidade térmica, a enzima manteve-se 100 % estável a 50 °C e conservou mais de 90 % de atividade relativa após 120 minutos a 60 °C. Em 70 °C, demonstrou completa instabilidade já nos primeiros 5 minutos de incubação. Com relação ao pH ótimo, a maior atividade foi observada em pH 5,0. Quanto à estabilidade em diferentes faixas de pH, a pectinase de C. echinulata PA3S12MM revelou-se altamente promissora para aplicações industriais, mantendo atividade residual superior a 80 % em pH 5 e acima de 100 % na faixa alcalina entre pH 7 e 10. Discussão: A atividade enzimática máxima observada em 50 °C está de acordo com dados da literatura, nos quais a desnaturação proteica se torna predominante em temperaturas superiores à ótima, levando à inativação da enzima (KABIR & JU, 2023). Comportamento semelhante foi observado por Bhattacharyya et al. (2021), que relatou temperaturas ótimas de 50 °C para pectinases de Aspergillus terreus. Em relação à estabilidade térmica, o desempenho observado supera o relatado por Ahmed & Sohail (2020) para a pectinase de Geotrichum candidum, que reteve 100 % da atividade apenas a 30 °C por 1 hora. Quanto ao pH ótimo, a atividade em pH 5,0 corrobora com dados já descritos para pectinases ácidas produzidas por fungos, como demonstrado por Zhong et al. (2021) para uma pectinametilesterase de Paenibacillus xylanexedens. Esse tipo de enzima tem grande potencial na redução da turbidez e do amargor em sucos de frutas, já que a maioria apresenta pH ácido, sendo aplicável à etapa de clarificação na indústria alimentícia (PRAJAPATI et al., 2021). Além disso, a estabilidade em ampla faixa de pH indica versatilidade industrial. Enquanto De Souza (2010) descreveu uma pectinase estável entre pH 3,5 e 5,5, mas instável em pH acima de 6,5, os dados atuais sugerem um desempenho promissor da enzima de C. echinulata PA3S12MM em ambientes com pH variado. Conclusão: A partir dos resultados obtidos, pode-se inferir que a pectinase de C. echinulata PA3S12MM apresenta condições ótimas de reação enzimática a 50 °C e pH 5,0. Além disso, ela demonstra uma alta estabilidade em pHs e temperaturas elevadas, o que confere um grande potencial biotecnológico para sua aplicação industrial, principalmente na clarificação de suco de frutas.
Referências: AHMED, A., SOHAIL, M. Characterization of pectinase from Geotrichum candidum AA15 and its potential application in orange juice clarification. J. King Saud Univ. Sci., 32 (1), 955–961, 2020. BHATTACHARYYA, R., MUKHOPADHYAY, D., NAGARAKSHITA, V. K., BHATTACHARYA, S., DAS, A. Thermostable and organic solvent-tolerant acid pectinase from Aspergillus terreus FP6: purification, characterization and evaluation of its phytopigment extraction potential. 3 Biotech, 11 (11), 487, 2021. de SOUZA, R. L., OLIVEIRA, L. D. S., DA SILVA, F. L., & AMORIM, B. C. Caracterização da poligalacturonase produzida por fermentação semi-sólida utilizando-se resíduo do maracujá como substrato. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, 14, 987-992, 2010. JOHN, J., KAIMAL, K. S., SMITH, M. L., RAHMAN, P. K., & CHELLAM, P. V. Advances in upstream and downstream strategies of pectinase bioprocessing: A review. International Journal of Biological Macromolecules, v. 162, p. 1086-1099, 2020. KABIR, M. F., JU, L. K. On optimization of enzymatic processes: temperature effects on activity and long-term deactivation kinetics. Process Biochem., 2023. LASWAI, F. C.; MATOFARI, J. W.; NDUKO, J. M. Pectinolytic enzyme production from orange processing waste using Aspergillus brasiliensis strain. Biomass Convers. Biorefin., 14(20), 25173–25186, 2024. MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry, v. 31, n. 3, 426-428, 1959. SINGH, B.; SONI, S. K.; MATHUR, P.; GARG, N. Microbial multienzyme viz., pectinase, cellulase and amylase production using fruit and vegetable waste as substrate—a review. Appl. Microbiol., 4(3), 1232–1246, 2024. ZHONG, L., WANG, X., FAN, L., YE, X., LI, Z., CUI, Z., & HUANG, Y. Characterization of an acidic pectin methylesterase from Paenibacillus xylanexedens and its application in fruit processing. Protein Expression and Purification, 179, 105798, 2021.